Caracterización de la respuesta inmune celular frente al virus del Dengue (DENV- 2 y DENV-4), mediante citometría de flujo espectral en co-cultivos autólogos de monocitos-linfocitos
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Resumen en español
El dengue es una arbovirosis con un alto impacto en la salud pública, causada por cuatro serotipos que están genéticamente relacionados, pero antigénicamente distintos (DENV-1 a DENV-4) y es transmitidos por mosquitos del género Aedes. En Panamá, la reintroducción del serotipo DENV-4 en 2023 tras 20 años sin circulación, junto a la co-circulación de DENV-1, DENV-2 y DENV-3, configuró un escenario complejo. Este fenómeno de hiperendemicidad aumenta el riesgo de infecciones secundarias y del fenómeno de potenciación dependiente de anticuerpos (ADE). Unas de las problemáticas actuales es la ausencia de modelos animales adecuados y tratamientos antivirales específicos, los modelos in vitro con células inmunes humanas primarias son herramientas esenciales para comprender la inmunopatogénesis viral. En este contexto, este estudio busco caracterizar la respuesta inmune celular frente a DENV-2 y DENV-4 mediante citometría de flujo espectral en co-cultivos autólogos de monocitos-linfocitos de 7 donantes sanos. Ambos serotipos fueron producidos en células Vero y titulados en células BHK por ensayo de placas; los monocitos CD14⁺ fueron aislados por selección magnética positiva a partir de PBMCs, infectados in vitro a MOI 0.5 y co-cultivados en proporción 1:2 con sus linfocitos autólogos. Se diseñó y estandarizó un panel multiparamétrico de 22 marcadores de superficie e intracelulares adquirido en el citómetro Cytek Northern Lights®. La estandarización del panel fue una etapa crítica: se titularon individualmente los anticuerpos utilizando el Stain Index como criterio de selección, evaluados en FlowJo™ v10.10.1. La evaluación computacional en Cytek Cloud arrojó un Stain Index global de 16.19, garantizando adecuada separación espectral. Este proceso permitió identificar y excluir. interferencias irresolubles como las del HLA-ABC/Streptavidin PerCP-eFluor 710, demostrando que el diseño computacional no sustituye la validación experimental. Se analizaron marcadores de activación, citotoxicidad y reconocimiento inmunológico: Nectin-2, DNAM-1, perforina, LAMP-1, TNF-α y NS3 en monocitos, linfocitos T CD4⁺, CD8⁺ y células NK. Aunque no se alcanzó significancia estadística, se observaron tendencias biológicamente plausibles. Este trabajo aporta un protocolo estandarizado de citometría espectral para el estudio de la inmunopatogénesis del dengue y sienta las bases para la identificación de biomarcadores con potencial diagnóstico y pronóstico.
Resumen en ingles
Dengue is an arboviral disease with a significant public health impact, caused by four genetically related yet antigenically distinct serotypes (DENV-1 through DENV-4) and transmitted by *Aedes* mosquitoes. In Panama, the reintroduction of the DENV-4 serotype in 2023 following a 20 year absence of circulation combined with the co-circulation of DENV-1, DENV-2, and DENV-3, created a complex scenario. This state of hyperendemicity increases the risk of secondary infections and the phenomenon of antibody-dependent enhancement (ADE). Given the current lack of suitable animal models and specific antiviral treatments, *in vitro* models using primary human immune cells serve as essential tools for understanding viral immunopathogenesis. In this context, this study sought to characterize the cellular immune response to DENV-2 and DENV-4 using spectral flow cytometry in autologous monocyte-lymphocyte co-cultures from seven healthy donors. Both serotypes were propagated in Vero cells and titrated in BHK cells by plaque assay; CD14⁺ monocytes were isolated by positive magnetic selection from PBMCs, infected in vitro at MOI 0.5, and co-cultured in a 1:2 ratio with their autologous lymphocytes. A 22-marker multiparametric panel of surface and intracellular markers was designed and standardized for acquisition on a Cytek Northern Lights® spectral cytometer. Panel standardization was a critical stage: individual antibody titration was performed using the Stain Index as the selection criterion, evaluated in FlowJo™ v10.10.1. Computational evaluation in Cytek Cloud yielded a global Stain Index of 16.19, ensuring adequate spectral separation. This process enabled the identification and exclusion of unresolvable spectral interferences — such as those from HLA-ABC/Streptavidin PerCP-eFluor 710, demonstrating that computational panel design does not replace experimental validation. Activation, cytotoxicity, and immunological recognition markers: Nectin-2, DNAM-1, perforin, LAMP-1, TNF-α, and NS3 were analyzed in monocytes, CD4⁺ and CD8⁺ T lymphocytes, and NK cells. Although no statistically significant differences were observed, biologically plausible trends were identified. This work provides a standardized spectral flow cytometry protocol for studying dengue immunopathogenesis and lays the groundwork for identifying biomarkers with diagnostic and prognostic potential.