Licenciatura en Biotecnología
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Examinando Licenciatura en Biotecnología por Autor "Bonner, Leighanne [autora]"
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Ítem Acceso abierto Clonación, sobreexpresión y purificación de la Cruzipaína Cepa Y(Universidad Latina de Panamá, 2026) Bonner, Leighanne [autora]; Alves-Rosa, María Fernanda [directora]La enfermedad de Chagas, causada por el protozoo Trypanosoma cruzi, continúa representando un importante problema de salud pública debido a la persistencia del parásito en el hospedador y a las limitaciones de las estrategias terapéuticas disponibles. La cruzipaína, principal cisteín-proteasa de T. cruzi, participa en procesos esenciales para la supervivencia, diferenciación, invasión celular y evasión de la respuesta inmune del parásito, convirtiéndose en una molécula de gran interés para estudios funcionales, inmunológicos y terapéuticos. La obtención de la cruzipaína recombinante constituye una herramienta fundamental para la generación de anticuerpos y el desarrollo de métodos de caracterización de esta proteína. En este trabajo se realizó la clonación, sobreexpresión y purificación de la cruzipaína de T.cruzi cepa Y, utilizando un sistema de expresión heterólogo basado en Escherichia coli Rosetta (DE3). El gen TcCruzipain fue amplificado mediante PCR de alta fidelidad y clonado en el vector de expresión pGEX-6P-1 Stu2, generando un constructo de fusión con la proteína glutatión S-transferasa (GST). Los clones recombinantes obtenidos fueron evaluados mediante análisis molecular, incluyendo PCR, digestión enzimática y secuenciación Nanopore, confirmándose la presencia del inserto y la identidad del constructo seleccionado. La expresión de la proteína recombinante GST-Czp fue evaluada bajo diferentes condiciones de inducción, seleccionándose condiciones optimizadas para la producción de la proteína en E. coli Rosetta (DE3). La proteína obtenida presentó el peso molecular esperado para la proteína de fusión y se localizó predominantemente en la fracción insoluble. En consecuencia, se implementó un protocolo de solubilización seguido de purificación mediante cromatografía de afinidad con resina Glutathione Sepharose 4B. Finalmente, la identidad de la proteína purificada fue confirmada mediante análisis inmunológico utilizando anticuerpos anti-GST. Los resultados obtenidos permitieron establecer una estrategia reproducible para la producción y purificación de la cruzipaína recombinante, generando una fuente confiable de antígeno para futuros estudios inmunológicos y funcionales. Esta plataforma constituye una herramienta de utilidad para la caracterización de la cruzipaína y aporta una base experimental para el desarrollo de nuevas aproximaciones diagnósticas, inmunológicas y terapéuticas dirigidas contra T. cruzi.